НАДЕЯТЬСЯ

Apr 19, 2024

Биология связи, том 6, Номер статьи: 474 (2023) Цитировать эту статью

1651 Доступов

21 Альтметрика

Подробности о метриках

Разработана технология фрезерования крио-фокусированным ионным пучком (крио-ФИБ) для изготовления криоламелей из замороженных нативных образцов для исследования методом криоэлектронной томографии in situ (крио-ЭТ). Однако точность интересующей цели по-прежнему остается одним из основных узких мест, ограничивающих применение. Здесь мы разработали систему криокрелятивной световой и электронной микроскопии (крио-CLEM) под названием HOPE-SIM, объединив систему 3D-флуоресцентной микроскопии со структурированным освещением (SIM) и модернизированную платформу высокого вакуума для достижения эффективного целевого крио-FIB. Благодаря сверхразрешению 3D крио-SIM, а также нашему программному обеспечению крио-CLEM, 3D-View, точность корреляции интересующей области может достигать 110 нм, достаточной для последующего изготовления криоламелей. Мы успешно использовали систему HOPE-SIM для подготовки криоламелл, нацеленных на митохондрии, центросомы клеток HeLa и компартмент сборки вируса герпеса инфицированных клеток BHK-21, что предполагает высокую эффективность системы HOPE-SIM для будущего крио-ET in situ. рабочие процессы.

Обнаружение трехмерных (3D) клеточных ультраструктур является важным шагом в понимании жизни. В последние годы криоэлектронная микроскопия (крио-ЭМ) становится все более усовершенствованной и становится одним из основных биофизических методов, используемых для изучения трехмерных структур макромолекулярных комплексов с высоким разрешением1. Кроме того, криоэлектронная томография (крио-ЭТ) стала еще одним мощным инструментом для визуализации макромолекулярной организации невозмущенных клеточных ландшафтов с потенциалом достижения разрешения, близкого к атомному2,3,4. Для визуализации субклеточной ультраструктуры в витрифицированных клетках с помощью крио-ЭТ было использовано измельчение сфокусированным ионным лучом в криогенных условиях (крио-ФИБ) для получения тонких криоламеллей из витрифицированных клеток, что позволило провести множество захватывающих биологических наблюдений внутри клеток. Трехмерная организация клеточных органелл, таких как цитоскелет5,6,7,8,9, эндоплазматическая сеть (ER)10 и 26S протеасома11, была успешно проанализирована с помощью крио-ЭТ.

Существует несколько ограничений, которые препятствуют более широкому применению крио-ЭТ, включая трудности с обнаружением и идентификацией представляющих интерес особенностей12. Криокорреляционная световая и электронная микроскопия (крио-CLEM)13,14,15,16,17,18 оказалась эффективным подходом к решению этой проблемы за счет использования флуоресцентной маркировки для навигации к цели для последующего крио-FIB. измельчение витрифицированных клеток14,15,16,17 или крио-ЭТ-визуализация замороженных гидратированных срезов12,18. Учитывая, что нормальная толщина клеток намного превышает длину свободного пробега электронов с энергией 300 кэВ, перед сбором данных крио-ЭТ необходимо изготовление остеклованных клеток толщиной ~ 200 нм. Таким образом, последовательная экспериментальная процедура, включающая витрификацию, криофлуоресцентную микроскопию (крио-ФМ), крио-ФИБ и крио-ЭТ, стала рутинным рабочим процессом для многих структурных исследований in situ, специфичных для конкретных участков12,19,20,21,22, 23. Для этого рабочего процесса обычно требуется автономный флуоресцентный микроскоп с крио-предметом для криофлуоресцентной визуализации15,16,17,24,25 с последующей криосканирующей электронной микроскопией (крио-СЭМ). Корреляционное соответствие между изображениями крио-ФМ и крио-СЭМ генерируется и используется для управления фрезерованием крио-FIB12,18,21,26. Кроме того, для корреляционного выравнивания с использованием специального 3D-корреляционного программного обеспечения необходимы специальные реперные маркеры, отображаемые как с помощью крио-FM, так и крио-FIB, такие как флуоресцентные шарики21,27. Сообщалось о многих аппаратных реализациях для реализации этого рабочего процесса путем разработки криогенной широкопольной флуоресцентной микроскопии13,21,22 или крио-Airyscan-конфокальной микроскопии высокого разрешения (CACM)12.

Точность корреляции и вероятность успеха между крио-FM и крио-FIB ограничены разрешением крио-FM и дополнительно ослаблены факторами деформации образца, расстекловывания и загрязнения льдом7,21. Ранее мы разработали уникальную высоковакуумную оптическую платформу для крио-CLEM (HOPE)25, в которой использовался встроенный криодержатель и специальная вакуумная камера для минимизации загрязнения льдом и снижения риска деформации образца и расстекловывания во время крио-FM визуализации и перенос образца. Однако использование широкопольного флуоресцентного микроскопа с объективом с низкой числовой апертурой (NA) и без информации о положении z флуоресцентных мишеней в нашей системе HOPE ограничило точность корреляции выше одного микрона, которую необходимо улучшить. чтобы повысить вероятность успеха фрезерования крио-ФИБ на конкретном участке.